Měření indukované fluorescence chlorofylu
Domů ׀ Laboratoře ׀ Fluorescenční laboratoř
Metoda využívá poznatku objeveného už ve třicátých letech 20. století (Kautsky and Hirsch 1934), že fotosyntetizující organismy obsahující chlorofyl-a vyzařují určitou část zachycené světelné energie zpět ve formě fluorescenčního záření ve viditelné oblasti spektra (především červené až infračervené okolo 685 nm a 735 nm). Později byl tento fenomén vysvětlen jako součást systému mechanismů pro odvádění přebytečné energie získané ze zachycených fotonů.
Fluorescence molekul chlorofylu je čistě fyzikální jev, ve změnách intenzity vyzařované fluorescence se však odráží průběh fotochemických reakcí tzv. primární (světelné) fáze fotosyntézy: zachycení fotonů, excitace molekul chlorofylu-a jejich energií a uvolnění energeticky obohacených elektronů, z nichž je energie předána a uložena do makroergních vazeb v molekulách ATP a NADPH2 pro další využití.
Fluorescenční odezva je indukována krátkými pulsy slabého měřícího světla a je zaznamenávána pomocí citlivého detektoru. Ten je vybaven optickým filtrem tak, aby do něj pronikaly právě jen záblesky indukované fluorescence chlorofylu. Na základě dynamiky změn intenzity fluorescence sledované v čase lze popsat změny na biochemické úrovni fotosyntetického aparátu rostliny, řasy nebo sinice a nepřímo posoudit účinnost fotosyntézy u daného organismu. Fotosyntetický aparát fotoautotrofních organismů je velmi citlivý na změny podmínek prostředí, ať se jedná o faktory fyzikální (např. teplota, nadměrná ozářenost, UV-záření, sucho atd.) nebo chemické (deficience živin nebo přítomnost toxických organických sloučenin přirozených i umělých, např. herbicidů, dále vliv těžkých kovů, ozónu a dalších látek).
Výhodou této metody je, že měření je možné provést rychle, nedestruktivně a opakovaně, v laboratoři i v terénu. S úspěchem se využívá ve stresové fyziologii rostlin při studiu vlivu výše zmíněných faktorů. Za nevýhodu lze považovat často zaznamenání stejné, nespecifické reakce na různé typy stresových podnětů. To omezuje možnost využítí fluorescence chlorofylu jako přímého důkazu působení specifického faktoru, zejména při možném spolupůsobení více faktorů.
Fluorometry pro měření indukované fluorescence chlorofylu –
FluorCam MF700, AquaPen AP100, FL3500 FAST
Tyto fluorometry (vše Photon Systems Instruments, Brno, Česká republika) slouží k měření indukované fluorescence chlorofylu ve vztahu k fyziologickému stavu fytoplanktonu, především jeho fotosyntetické aktivitě. Na rozdíl od fluorescenčních sond typu FluoroProbe tyto fluorometry nelze běžně využít pro kvantifikaci a třídění skupin fytoplanktonu. Přístroje využívají pro excitaci (resp. indukci fluorescence) pouze 2 typy LED diod, modré (455 nm) nebo červené/červeno-oranžové (590 – 620 nm) podle typu přístroje a použitého nastavení, a zaznamenávají fluorescenci chlorofylu-a při 680 – 690 nm. Všechny tyto fluorometry běžně pracují v režimu PAM (Pulsní Amplitudová Modulace)(např. Roháček and Barták 1999), kdy vedle měřícího excitačního světla pro indukci fluorescence jsou využívány další zdroje záření – slabší aktinické světlo (obvykle modré nebo červené, vlnová délka do 620 nm) a silné saturační světlo (modré, červené nebo bílé, vlnová délka opět do 620 nm).
Měření probíhá tak, že vzorek je stále ozařován velmi krátkými a slabými pulsy měřícího světla, které vyvolává stejně krátké záblesky fluorescence (= pulsní modulace, záblesky o délce v řádu jednotek mikrosekund). V průběhu měření se pak podle potřeby vzorek navíc osvětluje středně silným stálým aktinickým nebo velmi silným saturačním světlem, které vyvolá změnu (obvykle zvýšení) intenzity fluorescenčního signálu (= amplitudová modulace). Výsledkem sledování takových změn v čase je kinetika fluorescence chlorofylu, křivka, která má u zdravých vzorků svůj typický tvar a určují se z ní např. hodnota základní fluorescence (F0 – souvisí např. s množstvím chlorofylu-a ve vzorku a množstvím funkčních fotosystémů s připojenými světlosběrnými komplexy), hodnota maximální fluorescence (FM – souvisí zejména s množstvím funkčních fotosystémů) a řada dalších parametrů, u nichž je znám jejich konkrétní vztah k procesům fotosyntézy, především její primární fáze („světelná“ fáze, fáze zachycení fotonů světla a uložení jejich energie do dočasných zásob v energetických sloučeninách ATP, NADPH). Nejčastěji uváděný parametr je právě poměr variabilní fluorescence (tedy rozdílu základní a maximální fluorescence) ku maximální fluorescenci (FV/FM). Jeho hodnota v rozsahu 0.0 – 0.823 udává maximální kapacitu fotosystémů PS II řas a sinic ve vzorku pro zachycování světelné energie (tzv. maximální kvantový výtěžek PS II).
Fluorometry AquaPen AP100 (zjednodušený terénní přístroj) a FL3500 FAST (velmi citlivý laboratorní přístroj) jsou vhodné pro měření suspenzí řas a sinic. Fluorometr FluorCam MF700 je zařízení typu „fluorescence imaging system“ vybavené kamerou, které umožňuje sledovat změny fluorescence na ploše vzorku, je určen především pro měření fluorescence na listech vyšších rostlin, ale lze jej využít např. i k měření většího počtu vzorků suspenzí řas a sinic napipetovaných v mikrotitrační destičce.
Algae Online Monitor (AOM)
Ve spolupráci s firmou Photon Systems Instruments, Drásov, Česká republika, byl na našem oddělení vyvíjen také přístroj Algae Online Monitor (AOM). Jedná se o zjednodušený PAM fluorometr s průtočnou měřící komorou, který využívá pro excitaci fluorescence střídavě LED diody o 2 vlnových délkách (455 nm a 590 nm), a díky tomu umožňuje jednak rozlišit a kvantifikovat ve vzorku dvě základní nejdůležitější skupiny fytoplanktonu, sinice a zelené řasy, a také stanovit některé základní parametry jejich fluorescence chlorofylu. Přístroj je upraven pro použití in situ v režimu kontinuálního měření. Množství fytoplanktonu ve vzorku je úměrné fluorescenční odezvě, pro výpočet slouží plocha pod křivkou grafu. Detekční limit se pohybuje kolem 300 až 400 buněk Microcystis aeruginosa/ml, což odpovídá přibližně 0,02 μg/l chlorofylu-a. Přístroj byl v reálných podmínkách testován v sezóně 2009-2010 a nyní je běžně dostupným komerčním produktem firmy PSI. Je vhodný pro instalaci např. do úpraven pitné vody, kde sleduje výskyt a složení fytoplanktonu v přitékající vodě a umožňuje rozhodnout o potřebě úpravy technologie čištění.
Literatura:
- Kautsky, H., Hirsch, A. 1934. Chlorophyllfluoreszenz und Kohlensäureassimilation. Das Fluoreszenzverhalten grüner Pflanzen. Biochem. Zeitschrift 274: 423-434.
- Roháček, K., Barták, M. 1999: Technique of the modulated chlorophyll fluorescence: basic concepts, useful parameters, and some applications. Photosynthetica 37(3): 339-363.