Hybridizace v komplexu druhů Triticum aestivum – Elytrigia intermedia – E. repens: příklad možného toku genů plodina – planý příbuzný

S rozvojem biotechnologií a nástupem geneticky modifikovaných plodin je spojeno i ohodnocení míry rizik s ním spojeným. Jedním typem takových rizik je únik transgenů do planých populací příbuzných druhů. K němu může docházet v důsledku hybridizace kulturní plodiny s jedinci planě rostoucích populací příbuzných taxonů. Konkrétním potenciálním příkladem na území Česka je hybridizace v komplexu druhů pšenice – pýr prostřední – pýr plazivý (Triticum aestivum – Elytrigia intermedia – E. repens). Zatímco pýr plazivý je všeobecně rozšířeným a známým plevelem, pýr prostřední je druhem poměrně vzácnějším. Roste na stepích a výslunných stráních v teplých oblastech, často na extrémních stanovištích. V menší míře v teplých oblastech proniká i na stanoviště čistě kulturní, jako jsou vinice a okraje polí. Zde se oba druhy pýru potkávají. Pýr prostřední bývá šlechtiteli používán pro zlepšení genetických vlastností pšenice, tyto druhy se tedy – prokazatelně zatím jen v kontrolovaných laboratorních podmínkách – kříží. Jak je to v přírodě, zatím není známo. Vzhledem k tomu, že pýr prostřední a pýr plazivý se také kříží – hybrid byl původně popsán z našeho území – teoreticky je možný genový tok z pšenice přes pýr prostřední do pýru plazivého. Základním předpokladem pro splnění cílů projektu bylo důkladné poznání variability obou druhů pýru v přírodních populacích.

Shrnutí výsledků

1. Značná variabilita populací Elytrigia intermedia v přírodě
   Na většině studovaného území se oba druhy jevily jako cytogeneticky a morfologicky dobře odlišitelné taxony. Efektivní metodou pro identifikaci a verifikaci původu se ukázala být průtoková cytometrie (Mahelka et al. 2005). Rozdíl v obsahu DNA mezi oběma druhy činil 16%. Tento rozdíl byl dostatečně velký i pro spolehlivou identifikaci hybridů, které sice bylo možné určit na základě morfologie, ale nepříliš spolehlivě. Rostliny obou druhů byly nejčastěji hexaploidní se 42 chromozómy, byly ovšem nalezeni i jedinci nonaploidní s počtem chromozómů 63. Variabilita u druhu E. intermedia však byla o poznání větší. Výsledky cytometrických a karyologických analýz, provedené na rostlinách z populace z lokality Čertoryje, ukázaly značnou variabilitu v cytotypech a především nekorelaci mezi obsahem DNA a počtem chromozómů u některých rostlin. Poměrně běžně se zde vyskytovaly heptaploidní rostliny (2n = 49), tj. rostliny mající oproti běžnému hexaploidnímu cytotypu o jednu haploidní sádku chromozomů navíc. Bělokarpatské lokality se značně liší ekologicky od ostatních, víceméně stepních lokalit tohoto druhu v České republice. Pýr prostřední zde roste v mezotrofních až střídavě vlhkých porostech svazů Molinion a Bromion. Při podrobném vyhodnocení rozšíření hybridů na lokalitě Čertoryje se ukázalo, že prostor s jejich velkým zastoupením se kryje s plochou, kde byl před několika lety proveden velmi razantní ochranářský zásah, při kterém byla najednou bez zapojené vegetace poměrně velká část lokality. V té době zřetelně došlo k uchycení velkého množství jedinců, z nichž část byly aneuploidy. Tyto výsledky částečně změnily směr výzkumu projektu, a vedly k rozhodnutí analyzovat genomy obou druhů Elytrigia podrobněji za účelem zjistit, zda-li vůbec jsou tyto taxony v rámci našeho území geneticky uniformní, tj. jestli mají stejnou genomickou konstituci (viz. bod 3).
2. Studium hybridizace a introgrese mezi E. intermedia a E. repens
   Pomocí námi vyvinutých markerů na jaderné (ITS rDNA) a chloroplastové (trnL-F) DNA proběhlo vyhodnocení a ověření populačních vzorků sebraných v roce 2005 (Mahelka et al. 2005). Marker na jaderné DNA ověřil hybridní původ všech 63 rostlin, dříve determinovaných pomocí průtokové cytometrie jako hybridní. Směr hybridizace byl zjišťován pomocí chloroplastové DNA, přičemž v 61 případech ze 63 byla mateřskou rostlinou E. intermedia. Také jsme analyzovali 9 nonaploidních rostlin, z nichž osm se ukázalo být hybridy mezi E. repens a E. intermedia a jedna rostlina nonaploidním cytotypem od E. repens. Nonaploidní cytotypy pravděpodobně vznikly splynutím redukované a neredukované gamety. Jedna nonaploidní rostlina byla částečně plodná, a potomstvo vykazovalo variabilitu jak v chromozómových počtech, tak v obsahu DNA. To ukazuje na zpětné křížení nonaploidní mateřské rostliny s hexaploidními cytotypy. Na téma hybridizace mezi E. intermedia a E. repens v přírodních populacích jsme publikovali článek v Annals of Botany (Mahelka et al. 2007). Výsledky z této části projektu zcela jasně ukázaly, že mezi Elytrigia repens a E. intermedia neexistuje efektivní reproduktivní bariéra, která by bránila genovému toku; ta neexistuje dokonce ani mezi hexaploidními a nonaploidními (9x) rostlinami. Míra hybridizace byla na každé studované lokalitě odlišná, jediné zobecnění, které je možno udělat je, že lokality s větší antropogenní disturbancí mají stupeň hybridizace (měřeno frekvencí hybridů) podstatně větší, než stepní lokality. Zda je to způsobeno zvýšenou frekvencí uchycení či stresovými podmínkami, není možno říci. Na antropogenních lokalitách je tedy riziko genového toku mezi vzácnějším druhem (E. intermedia) a jedním z nejčastějších plevelů (E. repens) podstatně větší, což je důležitý výsledek i s ohledem na potenciální křížení s pšenicí. Během navazujícího experimentu s pěstováním obou druhů pýru a jejich hybridem na vodním gradientu (Mahelka 2006), simulujícím zaplavení stanoviště, bylo zjištěno, že E. repens je druhem, který nejvíce prosperuje v anaerobních podmínkách. E. intermedia byl k zaplavení nejméně tolerantní, a hybrid vykazoval střední toleranci k zaplavení. Z experimentu vyplývá, že hybridizace mezi oběma druhy může vést ke zvýšení adaptability.
3. Studium genomické kompozice Elytrigia intermedia a E. repens
   V rámci tohoto projektu bylo studium genomické kompozice započato a dosažené výsledky nebyly v rámci projektu publikovány. Pro tento účel jsme vybrali dva lokusy na jaderné DNA: ITS rDNA, který jsme u obou druhů pýrů studovali již dříve, a jednokopiový gen (granule-bound starch synthase I, GBSSI), který byl s úspěchem použit pro stanovení genomové konstituce druhu E. repens dříve v pracech jiných autorů. Následně byly rostliny analyzovány metodou genomické in situ hybridizace pro potvrzení výsledků získaných pomocí těchto markerů. Pro tyto analýzy jsme vybrali 4 rostliny z různých oblastí, aby byla alespoň částečně podchycena možná variabilita závislá na geografickém rozšíření. Jedna rostlina od každého druhu pocházela z lokality Čertoryje. Genomická konstituce druhu E. repens víceméně odpovídala již dříve publikovaným výsledkům jiných autorů, kdy na složení genomu se podílí dvěma subgenomy Pseudoroegneria a jedním subgenomem Hordeum. Kromě těchto hlavních konstituentů genom E. repens obsahuje příměsi cizorodého genetického materiálu, odpovídajícímu překvapivě vzdáleným druhům (Mahelka, Kopecký 2010). U druhu E. intermedia jsme objevili nové zajímavé aspekty. Původci dvou subgenomů pravděpodobně byli zástupci rodů Pseudoroegneria a Dasypyrum. Původ třetího subgenomu nebyl zcela vysvětlen. Patrně se jedná o hybridní genom s příměsí Thinopyrum a u dvou rostlin překvapivě také z okruhu Aegilops/Triticum (Mahelka et al. 2011).
4. Studium hybridizace mezi Triticum aestivum a E. intermedia
   K tomuto bodu se vztahují bezprostředně výsledky uvedené v bodu 3. Nález jedinců E. intermedia, kteří mají v sobě zahrnutou část genomu Triticum/Aegilops nesmírně zkomplikoval situaci spojenou s hodnocením hybridizace mezi pšenicí a Elytrigia intermedia. Tito jedinci pocházejí ze vzdálených lokalit (Bílé Karpaty, Podbořansko), což svědčí o tom, že nejde o výsledek recentní hybridizace. To velmi ztěžuje hledání recentních hybridů mezi pšenicí a Elytrigia intermedia (bude nutno prokazovat, že nejde o tuto starou hybridizaci). Tento výsledek má ještě velmi významný obecný poznatek: variabilita populací některých druhů v přírodě je tak velká, že nemáme ani představu o tom, jak. To nesmírně komplikuje odhady možných procesů, např. odhady četnosti hybridizace. Poznatky získané na několika populacích nemusí vůbec platit na jiných. A odhad velikosti reprezentativního vzorku je závislý právě na znalosti této neznámé variability.

Publikované práce

Mahelka V, Kopecký D, Paštová L. (2011). On the genome constitution and evolution of intermediate wheatgrass (Thinopyrum intermedium: Poaceae, Triticeae). BMC Evolutionary Biology 11: 127.

Mahelka V., Kopecký D. (2010). Gene capture from across the grass family in the allohexaploid Elymus repens (L.) Gould (Poaceae, Triticeae) as evidenced by ITS, GBSSI, and molecular cytogenetics. Molecular Biology and Evolution 27: 1370–1390.

Mahelka V., Fehrer J., Krahulec F., Jarolímová V. (2007): Recent natural hybridization between two allopolyploid wheatgrasses (Elytrigia, Poaceae): Ecological and evolutionary implications. Annals of Botany 100: 249–260.

Mahelka V. (2006). Response to flooding intensity in Elytrigia repens, E. intermedia (Poaceae: Triticeae) and their hybrid. Weed Research 46: 82–90.

Mahelka V., Suda J., Jarolímová V., Trávníček P., Krahulec F. (2005). Genome size discriminates between closely related taxa Elytrigia repens and E. intermedia (Poaceae: Triticeae) and their hybrid. Folia Geobotanica 40: 367–384.

Financování

QC1362 Příprava návrhu pro hodnocení rizika GMO pro účely zákona o GMO a včetně modelového řešení u vybraných organismů a vytypování rizikových oblastí.
Poskytovatel: Ministerstvo zemědělství (MZe), Hlavní příjemce: Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., Období řešení projektu: 2001-2005.

GA206/05/0778 Hybridizace v komplexu druhů Triticum aestivum – Elytrigia intermedia – E. repens: příklad možného toku genů plodina – planý příbuzný.
Poskytovatel: Grantová agentura České republiky (GA ČR), Hlavní příjemce: Botanický ústav AV ČR, v. v. i., Období řešení projektu: 2005-2007.

Kontakt:
prof. RNDr. František Krahulec, DrSc.
Tel.: 271015283
e-mail: krahulec@ibot.cas.cz