Fluorescenční laboratoř
Princip měření fluorescence fotosyntetických pigmentů
Fotoautotrofní organismy (sinice, řasy, rostliny) využívají za účelem produkce organických látek energii fotonů absorbovaného světla v procesu tzv. fotosyntézy. Tato energie však není plně využita pro průběh fotosyntetických reakcí. Část nadbytečné energie je vyzářena do okolí jako teplo, další část je pak emitována jako tzv. fluorescence. Fluorescence je popisována jako fyzikální jev, kdy absorpce fotonů světla určité vlnové délky molekulou fluoreskující látky vyvolává emisi fotonů o vyšší (tj. energeticky méně bohaté) vlnové délce. Měření fluorescence pigmentů, zejména chlorofylu, může být využito např. k nepřímé kvantifikaci fytoplanktonu ve vzorcích z vodního prostředí. Protože fluorescence chlorofylu se navíc v průběhu času mění v závislosti na probíhající fotosyntéze, lze tak pomocí jejích charakteristik popsat okamžitý stav fotosyntetického aparátu sledovaného organismu.
Část fotosyntetického aparátu fotoautotrofních organismů, odpovědná za zachytávání světelné energie, je tvořena pigment-proteinovými komplexy obsahujícími chlorofyl-a a další přídatné pigmenty (chlorofyl-b, fykocyanin, fykoerythrin, fukoxantin, peridinin atd.), které se liší schopností absorbovat fotony různých vlnových délek viditelného světla a pomáhají tak zachycovat více fotonů světla a předávat jejich energii na chlorofyl-a. Přítomnost různých přídatných pigmentů je specifická pro jednotlivé skupiny fytoplanktonu. Podle barvy pigmentů se rozlišují skupiny: „modrá“ (sinice), „zelená“ (zelené řasy), „hnědá“ (rozsivky, obrněnky), „červená“ (ruduchy) a „smíšená“ (skrytěnky). V případě excitace světlem o vhodné vlnové délce většina pigmentů vyvolá díky přenosu zachycené energie emisi fluorescence z molekuly chlorofylu-a, některé pigmenty však vykazují i vlastní fluorescenci. V případě optimální konfigurace měřících přístrojů může fluorescence pigmentů podat nejen informaci o celkovém množství chlorofylu-a, ale i o poměrném zastoupení jednotlivých skupin fytoplanktonu v měřeném vzorku a při použití metody indukované fluorescence chlorofylu také o fyziologickém stavu fytoplanktonu, především o aktivitě jeho fotosyntézy. Hlavní výhodou měření fluorescence je rychlost a snadnost. Měření není destruktivní a může být prováděno opakovaně jak v laboratoři, tak i v terénu.
Podle způsobu měření fluorescence jsou přístroje ve fluorescenční laboratoři rozděleny na spektrofluorometry (viz níže), které zaznamenávají fluorescenci jako důsledek excitace pigmentů vhodnou vhodnou vlnovou délkou světla, a fluorometry, které měří změny indukované fluorescence chlorofylu jako důsledek změn ve fotosyntetické aktivitě organismu.
Spektrofluorometry – FluoroProbe, BenthoFluor, BenthoTorch
Na našem pracovišti používáme sondy od firmy bbe Moldaenke GmBH : ponornou sondu FluoroProbe pro měření ve vodním sloupci a sondy BenthoFluor a BenthoTorch pro měření na površích. Všechny tyto sondy využívají pro excitaci LED diody různých vlnových délek (v případě FluoroProbe např. 370 nm, 470 nm, 525 nm, 570 nm, 590 nm a 610 nm). Emise je měřena při fixní vlnové délce 680 nm (fluorescence chlorofylu-a). Na základě excitačních spekter je možno rozlišit ve vzorku následující skupiny fytoplanktonu: zelené řasy, sinice, obrněnky, rozsivky a skrytěnky. Množství biomasy je automaticky přepočítáváno na μg chlorofylu-a/l. Výrobce uvádí detekční limit 1 μg/l. Horní mez detekce, jsou-li ve vzorku dominantní skupinou sinice, je podle našich zkušeností kolem 50 μg/l.
Sondu FluoroProbe je možno využít pro stanovení objemu biomasy fytoplanktonu ve vodě a to jak v laboratoři (pomocí kyvetového nástavce), tak i in situ ve vodním sloupci nádrže (až do hloubky 100 m v závislosti na délce měřícího kabelu) nebo vodního toku. Díky vestavěnému hloubkovému a teplotnímu čidlu je navíc možné vytvořit vertikální profil výskytu různých skupin fytoplanktonu v různých hloubkách vodního sloupce.
Pomocí sond BenthoFluor a BenthoTorch je možno stanovovat nárosty fotoautotrofních společenstev na různých površích – fytobentosu na sedimentech dna a ponořených kamenech, suchozemských nárostů na povrchu kamenných nebo betonových staveb, památkových objektů, nebo kůře stromů apod.
Fluorometry pro měření indukované fluorescence chlorofylu
Pro hodnocení fyziologického stavu a především fotosyntetické aktivity řas a sinic využíváme fluorometry společnosti Photon Systems Instruments (Brno, Česká republika) FluorCam MF700, kyvetový laboratorní fluorometr FL3500 FAST a kapesní terénní fluorometry AquaPen AP 100 v kyvetové verzi a verzi s ponornou sondou. Bližší informace o těchto přístrojích a také o indukované fluorescenci chlorofylu naleznete na tomto odkazu.
Vybrané publikace k dané problematice:
- Gregor, J., Maršálek, B. (2004): Freshwater phytoplankton quantification by chlorophyll a: a comparative study of in vitro, in vivo and in situ methods. Water Research 38(3): 517-522.
- Gregor, J., Maršálek, B. (2005): A simple in vivo fluorescence method for the selective detection and quantification of freshwater cyanobacteria and eukaryotic algae. Acta Hydrochimica et Hydrobiologica 33(2): 142-148.
- Gregor, J., Maršálek, B., Šípková, H. (2007): Detection and estimation of potentially toxic cyanobacteria in raw water at the drinking water treatment plant by in vivo fluorescence method. Water Research 41(1): 228-234.
- Gregor, J., Jančula, D., Maršálek, B. (2008): Growth assays with mixed cultures of cyanobacteria and algae assessed by in vivo fluorescence: One step closer to real ecosystems? Chemosphere 70(10): 1873-1878.